＜PCRによるMRD評価と臨床転帰との関連性＞
PCRによるMRD評価と臨床転帰の関連性が示されている（図5）。NPM1変異を有するAML患者の検体を用いて、変異型NPM1遺伝子の転写産物をMRDとして逆転写PCR法により検出したところ、化学療法2サイクル終了時にMRD陽性であった患者では、3年後の再発リスクが高く（陽性群82%、陰性群30%、単変量ハザード比4.80、95%CI 2.95-7.80、p<0.001、Cox回帰）、生存率が低かった（陽性群24%、陰性群75%、単変量ハザード比4.38、95％CI 2.57-7.47、p<0.001、Cox回帰）^18）。さらに、共存変異としてFLT3-ITD変異を有する患者では、MRD陽性例における累積再発率が92％と、MRD陰性例の35%よりも有意に高いことが示された（p＜0.001、log-rank検定）（図5）^18）。

• NGS（次世代シークエンシング、next-generation sequencing）
  NGSは、数百万個に及ぶ小さなDNA断片の塩基配列を同時かつ並行して解読する技術である^11,13）。近年、AMLにおける体細胞変異を同定するためのNGSをベースとしたマルチ遺伝子検査が、ローカルの臨床検査室でも日常的に行われるようになっており、AML診断時のリスク評価等に役立てられているが、このマルチ遺伝子検査が治療後のMRD評価にも適用できると考えられている^19）。治療前と治療後の両方で同じNGSアッセイを使用することで、検査の外注に伴う運用面/経済面での障壁を軽減し、より多くの患者でMRD評価が実施できるようになる^19）。また、ローカルの臨床検査室における連続的な検査により、NGSで同定された体細胞変異がMRD評価に有用なバイオマーカーであることを検証するのに役立つ^19）。さらに、NGSはPCRと組み合わせることも可能であり、PCRによって目的の遺伝子を増幅させ、独自のソフトウェアプログラムを用いてNGSを行うことで感度を向上させることができる^20）。

＜NGSによるMRD評価と臨床転帰との関連性＞
NGSによるMRD評価と臨床転帰の関連性が示されている（図6）。少なくとも一つ以上の体細胞変異を有するAML患者において、初回導入化学療法後にMRD陽性であった場合、MRD陰性であった場合よりもOS中央値が有意に短く（陽性群 17ヵ月、陰性群 到達せず、p=0.0036、log-rank検定、死亡のハザード比2.2、95％CI 1.3-3.7、Cox比例ハザード解析）、再発までの期間の中央値も有意に短かった（陽性群13.6ヵ月、陰性群 到達せず、p=0.014、Gray検定、ハザード比1.9、95％CI 1.1-3.1、Cox比例ハザード解析）^19）。

• ctDNA（腫瘍由来循環DNA、circulating tumor DNA）
  ctDNAとは血漿中に遊離している細胞外遊離DNA（cell free DNA：cfDNA）のうち、腫瘍が壊死や細胞死を起こした際に放出されるDNA成分を指した呼称である^21）。ctDNAを用いた遺伝子解析は採血で検体採取ができるため、腫瘍病変部位の生検と比較して低侵襲で頻回に検査を実施できる利点から、固形腫瘍を中心に注目され、液体生検（liquid biopsy）と呼ばれている^21）。造血器腫瘍においても、骨髄検査やリンパ節生検など侵襲を伴う検査の代わりにctDNAを用いた遺伝子検査が社会実装されるようになれば、より早く、より簡便かつ頻回にMRDをモニタリングできるようになると期待される^21）。特にAMLにおける同種（allo-）HSCT後の再発を予測する非侵襲的で高感度なバイオマーカーへのニーズが高いことから、国内でctDNAの有用性が検証されている^21）。
  NGSによりドライバー変異が検出されたAMLまたはMDS患者51例の移植後1ヵ月、3ヵ月における検体を後方視的に解析したところ、ctDNAや骨髄中のドライバー変異が残存している患者では累積再発率が有意に高く、全生存率が有意に低かった（図7）。また、診断時の骨髄検体と血清ctDNAにおけるドライバー変異の変異アレル頻度（VAF）が相関していたことからも（R²=0.67、p＜0.0001、t検定）、血清を用いたctDNAによる評価は、骨髄検査の非侵襲的な代替となる可能性が示唆されている^21）。

• その他の末梢血を用いたMRD測定（PB MRD）の可能性
  ctDNAの他にも、末梢血（peripheral blood：PB）検体に由来したMRD評価法が検討されている。cfDNAは、アポトーシス、ネクローシス、活性分泌を受けた正常細胞や腫瘍細胞に由来するDNA断片が含まれていることから、血液や骨髄検体よりも包括的な腫瘍情報を含む、同等または優れた分子診断ツールである可能性が期待されている^22）。
  本邦で汎用されている末梢血WT1定量検査はAMLに非特異的ではあるものの、寛解導入後早期のWT1 MRD結果と予後が相関することから、他に適当なMRD検査標的がない場合にはMRD検索対象として考慮しても良いとされる^8,23)。

現在、MRD測定に広く利用されているMFC、PCR、NGSなどの検査方法における限界の克服を目指して、次のような新しい技術が開発されている。

• エラー訂正型NGS（error-corrected next-generation sequencing：ecNGS）
  ecNGSとは体細胞変異を正確に測定するための新しい技術であり^24）、その手法の一つとしてDuplex Sequencing^25）がある。NGSは1回の測定で数千億のDNA塩基配列を生成する能力を有する一方で、エラー率は～1％であるために、数億の配列ミスが生じる可能性があることから、シーケンス精度を向上するためにDuplex Sequencingが開発された^25）。Duplex Sequencingでは、DNA2本鎖の塩基配列をそれぞれ独立して決定し、比較する。DNA2本鎖は相補的であるため、真の変異は両方の鎖の同じ位置で発見されるが、エラーは片方にしか見られないため、エラーを削減できる^25）。
  
  
• 全ゲノムシーケンス解析を活用したMRD検査（whole-genome sequencing based MRD tests：WGS-MRD）
  WGSとはNGSを用いて全ゲノム領域を解読する包括的な手法であり、近年はNGS技術の進歩やコスト削減などを背景に、迅速なWGSが受けられる固形腫瘍が増えている^26）。固形腫瘍においてWGSデータは、腫瘍固有の遺伝子配列の決定や、患者固有のMRD定量アッセイの開発に活用されており、造血器腫瘍においても同様に、WGSデータを用いた患者特異的なMRDアッセイの開発が期待されている^26）。
  
  
• 液滴デジタルPCR（droplet digital PCR：ddPCR）
  ddPCRでは、水-油エマルジョン技術を用いて核酸サンプルを数千ナノリットルサイズの微小な液滴に分割し、これらの液滴内で個別にPCR増幅を行う^27）。増幅のあった液滴をポジティブ（1）、増幅のなかった液滴をネガティブ（0）としてコピー数をカウントし、ポアソン統計を使って正規化した上で、サンプルにおける標的の濃度を決定する^27）。ddPCRのメリットとして、シグナル・ノイズ比の向上や検量線を必要としない絶対定量などが挙げられる^27）。
  
  
• Single-cell transcriptomics（シングルセルトランスクリプトーム解析）
  シングルセル解析とは、一細胞レベルでのDNA配列、RNA発現量、蛋白発現量、エピゲノム修飾などを解析することであり^28）、シングルセルDNAシーケンス（scDNA-seq）では、数千の細胞における標的がん関連遺伝子の迅速なシングルセルジェノタイピングが可能となっている^29）。scDNA-seqを用いた単一細胞レベルでの遺伝子解析によって、AMLに関連したドライバー変異の細胞レベルでの共起や排他性が明らかとなり、線形および分岐パターンでのクローン進化を正確に描写できることが報告されている^29）。
  
  
• getITD（解析プログラム）
  getITDとは、ITD変異を正しく識別するためのオープンソースの解析プログラムである^30）。FLT3-ITD変異はAMLにおいて予後不良のドライバー変異であるものの、従来のPCR法では、感度が低い、または労力を要するためにMRD評価の標的とするには困難があった^30）。そこで新たな解析プログラムのgetITDが開発され、Targeted high-coverage NGSを組み合わせることで、幅広い長さ、挿入部位、アレル頻度のITDを高い精度と正確性で検出できるようになった^30）。また、手作業による解析を必要とせず、完全に客観的な分析であることから、日常的な臨床モニタリングに適用できる^30）。

引用文献

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