FLT3遺伝子変異の検査には、PCR（polymerase chain reaction）法および電気泳動法を用いた検出法のほか^1）、次世代シークエンサー（Next-Generation Sequencer：NGS）を用いたがん遺伝子パネル検査などがある。FLT3遺伝子の2種類の変異解析を1つの検査系で行うことは難しく、それぞれに対して検査系を構築し測定・解析を行う必要があり、従来は各施設で開発された方法（laboratory developed testing：LDT）で検査が行われてきた^2）。しかし、FLT3阻害薬の保険収載を受け、PCRベースの体外診断キットであるリューコストラットCDx FLT3変異検査^®が承認された^3）。

本検査は、FLT3阻害薬ギルテリチニブおよびキザルチニブの適応を判断するためのコンパニオン診断薬として承認を受けており^3,4）、FLT3-ITD変異およびTKD D835/I836変異の２つが検出できるように設計されている。急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia：AML）と診断された患者の末梢血あるいは骨髄液から得られた単核球から抽出したゲノムDNAをPCR法によって増幅させ、キャピラリー電気泳動法により増幅産物の長さを解析することで変異の有無を検出する。

• FLT3-ITD変異の検出
  長さ変異とも呼ばれるFLT3-ITD変異は、FLT3遺伝子内の膜近傍領域の内部および周辺領域を含む、FLT3遺伝子の一部分の重複と挿入によって起こる^5）。変異は挿入されたDNAの重複配列の位置や長さによって多様であるが、ITD変異を有すると、FLT3受容体の膜近傍領域が長くなり、FLT3リガンドの結合なしに二量体を形成し、チロシン残基の恒常的なリン酸化および活性化をもたらす^6）。
  リューコストラットCDx FLT3変異検査^®では、FLT3遺伝子の膜近傍領域に対応するプライマーを使用する。それぞれ異なる物質で蛍光標識した順行プライマーと逆行プライマーを使用してPCR法を行い、DNA増幅産物のフラグメントサイズのシグナルをキャピラリー電気泳動法により測定する^1,4）。野生型では増幅産物の長さが327±1bpであるが、ITD変異では327±1bpを超える長さの増幅産物が確認される（図1）^1,3,4）。

• FLT3-TKD変異の検出
  FLT3-TKD変異は、チロシンキナーゼ（TK）2領域のactivation loop（A-loop）内における835番目のアスパラギン酸残基（D835）のミスセンス変異であり、TKD変異によって恒常的なキナーゼ活性が起こり、FLT3受容体の自己リン酸化が亢進してシグナル伝達が活性化される^7）。D835以外にも、D593、I836、Y842等における置換や欠失がみられるが、リューコストラットCDx FLT3変異検査^®では、D835変異およびI836変異のみ検出可能である^4）。
  
  野生型FLT３遺伝子の対立遺伝子には、制限酵素であるEcoRVによって消化される塩基配列『GATATC』が含まれるが、D835またはI836に置換や欠失がある場合は、この制限酵素の認識部位が消失するため、EcoRVエンドヌクレアーゼがこの部位を認識・切断できなくなる^7）。本検査では、FLT3遺伝子のTKDの両端に対応するプライマーを使用してPCR法を行い、標的領域を増幅させた後にEcoRV制限酵素によって切断する。これらの増幅産物および消化産物のフラグメントサイズのシグナルをキャピラリー電気泳動法により測定する。野生型では79±1bpの長さの増幅・消化産物が得られるが、TKD変異では125±1bp（欠失）または127±1bp（置換）の増幅・消化産物が確認される（図2）^3,4,7）。

• ソフトウェアによる解析とFLT3遺伝子変異陽性の判定
  リューコストラットCDx FLT3変異検査^®では、ソフトウェアにより検査の妥当性が自動的に評価される^4）。検体と同時に処理された「FLT3抽出コントロール」、「FLT3 ITDポジティブコントロール」、「FLT3 TKDポジティブコントロール」および「FLT3 NTC」（no template control）が有効であるかを判定することで、それぞれのコントロールに関連付けられた試料の結果を判定する。有効でない場合はその詳細に応じた再検査開始点から繰り返す。
  ソフトウェアは、変異型：野生型シグナル比（SR）を計算して小数点以下2桁まで表示し、臨床的カットオフSR値0.05を自動的に評価する^4）。なお、野生型シグナルが未検出の場合には便宜上SR値が100と表示される。
  複数の変異を有するITD変異は全ての変異シグナルを合算する。本検査では、ITD変異の挿入は3～323bpのサイズが検出されるが、妥当性が確認されている挿入サイズは30～279bpであり、323bpを超えるITD挿入はITD変異として報告されない。また、本検査の検出感度に達していないFLT3変異は、検出されないことに留意が必要である。
  検体の変異状態は、表1のルールによって定義される。

次世代シークエンサー（NGS）とは、従来のキャピラリーシークエンサーに代わって塩基配列を決定する技術の総称である^8）。NGSの技術としては、以下の方法などが開発されている（表2）。NGSの技術革新のスピードは目覚ましく、最新（2025年2月時点）の機種（Illumina社 NovaSec X Plus）では1回の処理実行（system-run）で16T（16兆）ベースを読むことができる。なお、ヒトのゲノムサイズは約3G（30億）ベースである。

現在、NGSは様々なアプリケーションに用いられる^8）。例えば、mRNAを対象としたRNA-Seq解析は、遺伝子発現の定量やスプライシングの変化の評価に用いられる。また、免疫沈降によって特定の蛋白質に結合したDNAを対象とすることで、その蛋白質の結合配列の決定や結合パターンの評価が可能となる。
また、NGSは対象とするDNAの範囲によって「全ゲノムシークエンス」、「全エクソンシークエンス」「標的シークエンス」に分かれる（図3）^8,10）。現在、臨床シークエンスには「標的シークエンス」が使用されているが（表3）、今後も開発が進みコスト面の課題などが解消された場合には「全ゲノムシークエンス」が用いられるようになると予想される^8）。

2008年に染色体核型正常（CN-AML）のAML症例において実施された全ゲノムシークエンス解析結果が初めて報告されて以降、AML症例における全エクソンシークエンスの解析結果が相次いで報告されている^11,12）。2013年には、The Cancer Genome Atlas（TCGA）により、de novo AML症例200例の網羅的な遺伝子変異解析の結果が報告され（50例：全ゲノムシークエンス、150例：全エクソンシークエンス）、特に高頻度で同定された遺伝子変異はFLT3、NPM1、DNMT3Aの3種類であった^13）。

固形がんでは初回治療時の遺伝子パネル検査も先進医療として開始され、ゲノムプロファイリングに基づく個別化治療が推進されているが、造血器腫瘍は一般に進行が速く、検体の提出から結果返却までの時間の影響を受けやすいため^14）、通常は直ちに治療が開始され、初期治療に遺伝子パネル検査の結果を反映できない^15）。
米国で行われたBeat AML Master Trial^15）では、60歳以上の初発AML患者を対象に、ゲノムプロファイリングに基づいた個別化治療による予後への影響が検討されている。本試験の特筆すべき点は、ゲノム解析結果が検体提出から7日以内に返却されたことである。

日本血液学会では、『造血器腫瘍ゲノム検査ガイドライン（2023年度版）』を発行しており、「診断」、「治療法選択」、「予後予測」の観点におけるゲノム検査の臨床的有用性を記載している^16）。推奨度の詳細は表4の通りであり、初発AMLの治療選択や予後予測、再発AMLの治療選択において遺伝子パネル検査の実施が強く推奨されている（表5）。